PCNA 的 shRNA 的真核表达载体的构建及对子宫颈癌细胞的干预性研究

黄     浩1 , 凃 欣2 , 余南才1 , 吴文莉1 , 刘 倩1 , 马 威1 , 郝建军1 , 易艳东1

 

Constructed Eukaryotic Expression Plasmid of Small Hairpin RNA (shRNA) of PCNA and Investigated the Inhibitory Effect on Hela Cell

 

Huang Hao1 , T U Xin2 , YU Nan-cai1 , W U Wen-li1 , LIU Qian1 , M A Wei1 , HA O Jian-jun1 , YI Yan-dong1

 

1. Center of Ex perimenta l Medicine , Wuhan First Hospital , Wuhan 430022, China ;2. H uman Genome Research Center , H uazhong University of S cience & Technolog y

 

Abstract:Objective Constructed eukary otic e xpression plasmid of small hairpin RN A (sh RN A) o f PC-N A , then expre ssed plasmid in Hela cells and investig ated the inhibito ry effect of shRN A of PCN A on Hela ce ll ca rcino ma cell prolifera tion. Methods T he cDN A shRN A the prime of PCN A w as inserted into do wnstream of the vecto r pG enesil-1 to obtain the reco mbina nt euka ryo tic e xpression plasmid pGenesil-1-PCN A1-4 w hich we identified with the me tho ds o f enzy me dige stion and sequence analy sis. T he results were co nsistent with w hat we expected. A nd then transfected the recombinant plasmid pGe nesil-1-PC-N A 1-4 into eukary otic Hela cells by ca tionic po lyme r-mediated transfection. T he inhibition o f the Hela cell carcino ma cell proliferation w as e stimated by immunohistochemistry and western blo t method , the cell cy cle wa s analy sed by flow cy tomet ric. Results shRN A of PCN A inhibited the g ro wth rate o f He la cell and a rrested prolifera tion of H ela cell in phag e of G0 /G1-S. Conclusion sh RNA of P CNA might be effective in the behavio r o f Hela cell lines and inhibited the prolifera ting cell nuclear antig en by inhibiting e xpressio n of PCN A. T his result laid the founda tion fo r further researching in g ene the rapy of ute rine ce rvix carcino ma.

 

Key words:U terine cervix carcino ma ;Pro life rating cell nuclear antig en;Small hairpin RN A ;H ela cell

 

摘 要:目的 构建 P CNA 的小发夹结构 RNA(shRN A)的真核表达载体并在 Hela 细胞表达, 同时观察 PCN A 的 shRN A 对人 He la 细胞株体外增殖的影响及生物学特性的改变。 方法 将 P CNA 的 cD-N A 的 shRN A 引物插入真核表达载体 pGenesil-1 , 构建真核表达质粒 pG ene sil-1-PCN A1-4, 并通过酶切和测序等方法进行鉴定, 将真核表达质粒 pG enesil-1-P CN A 1-4 转染子宫颈癌细胞, 运用 Western blo t 检测 PCN A 的蛋白表达, 流式细胞仪分析细胞周期变化。 结果 PCNA 的 shRN A 能显著抑制人 Hela 细胞的生长, 阻滞细胞 G 0 /G1 —S 期, PCN A 的蛋白表达同时受到抑制。 结论 PCN A 的 shRN A 能显著抑制人 He la 细胞的生长, 其抑制作用可能通过阻断 P CNA 蛋白表达实现, 实验结果为进一步研究 PC-N A 的 shRN A 对子宫颈癌的基因治疗奠定了基础。

 

关键词:子宫颈癌:增殖细胞核抗原;小发夹结构 RN A ;子宫颈癌细胞

 

中图分类号:R737. 33          文献标识码:A      文章编号:1000-8578(2006)09-0662-03

 

 

0       引言

 

肿瘤的发生与基因突变及细胞增殖有关。增殖细胞核抗原(Prolife ra ting cell nuclear antigen , PC-NA)是在细胞周期 S 期广泛表达的一种核蛋白, 是一种仅在增殖细胞中合成和表达的 36KD 多肽 , 其功能是 DNA 聚合酶δ的重要辅助蛋白 ,在 DNA 合成中是绝对必需的, 在细胞增殖过程中有重要意义 , PCNA 阳性表达说明该细胞正处于增殖状态 。因

 

收稿日期:2005-08-24 ;修回日期:2005-11-09

 

作者单位:1. 430022 武汉市第一医院实验中心;2. 华中科技大学人类基因组研究中心

 

 

此 , PCNA 作为一项评估细胞增殖状态的指标不仅用于病理学研究, 而且近年来在肿瘤研究中的应用日渐增多^{[ 1]} 。

 

RNA 干预(RNA interference , RNAi)本质是一种双链 RNA(double-stranded RN A , dsRNA)分

 

子在 m RNA 水平上关闭相应序列基因的表达或使

 

其沉默的过程,也就是序列特异性的转录后基因沉默^{[ 2]} (po st-transcriptional gene silencing , PTGS )。 shRNA 是 45 - 50-m er 的小发夹结构 RNA (sm all hairpin RNA , shRNA ), 通过将其转染到细胞。 shRNA 在细胞内会自动被加工成为 siRNA , 从而引发基因沉默或者表达抑制^{[ 3]} 。

肿瘤防治研究 2006 年第 33 卷第 9 期	663

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

图 1  真核表达载体 pGenesil-PCNA-1-4 的构建

 

我们根据 PCNA 的 cDNA 的序列设计 shRNA 的引物 ,插入真核表达载体 pGenesil-1 , 构建正确的真核表达质粒 , 见图 1 , 导入 Hela 细胞中并研究其产生 siRNA 对 H ela 细胞干预的影响。为 RNAi 干预技术对肿瘤的基因治疗提供了实验理论和基础。

 

1       材料与方法

 

1. 1  细胞培养

 

He La 细胞引自武汉大学生命科学院, 培养于含 10 %小牛血清的 DM EM 的培养液中, 37 ℃5 % 的 CO2 条件下培养 ,0. 3 %的胰酶消化和传代。

 

1. 2  shRNA 设计和合成

 

根据 PCNA 基因序列(NM_ 182649), shRNA

 

设计规则及 blast 同源搜索选取 、设计四对引物及一对对照引物 ,每一对引物上游含 Bam H Ⅰ切点之后GA TCC 的粘性末端, 引物下游互补端含 Hind Ⅲ 切点的互补的 TTCGA 粘性末端 ,武汉市晶赛生物技术有限公司合成。

 

1. 3  PCNA 的 shRNA 的真核表达载体的构建

 

将真核表达载体 pGenesil-1 和经 Bam H Ⅰ ,

 

Hind Ⅲ双酶切后与纯化的含相应粘性末端的 PC-

 

NA 基因的 shRNA 四对引物片段和一对对照引物

 

片段 ,进行线性连接 ,连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 DH5α,经小量提取质粒测序鉴定 。构建的表达质粒称 pGenesil-PCNA-1 、 pGenesil-PCNA-2 、 pGenesil-PCNA-3 、pGene sil-PCNA-4 、pGenesil-PC-NA-H K 。

 

1. 4 阳离子聚合物(梭华 - So fast^TM /DNA 试剂盒)介导的细胞转染

 

细胞培养至 40 %～ 60 %汇合, 配制不同浓度的pGenesil-PCNA-1-4(浓度 5μg /ml 、7. 5μg /ml 、10μg / ml 、12. 5μg /ml 、15μg /ml)梭华- Sofast ^TM /DNA 复合物,进行转染,具体操作步骤见试剂盒说明书。

 

1. 5  流式细胞仪(FCM)检测

 

收集 1. 0 ×10⁶ 细胞, 用 70 %冷乙醇固定, 加 rNaseA (终浓度 50μg /ml),用 37 ℃水浴 1h , 加碘化丙啶(PI , 终浓度 20μg /ml), 暗处冰浴染色 1h 。用流式细胞仪检测细胞周期分布 , 用通过 M odF-

 

 

itLT 3. 1 软件分析。

 

1. 6    Western-blo t 定量检测 PCNA 蛋白

 

转染细胞如1. 4 , 收集转染及正常的细胞, 裂解液裂解 ,取 20μl 裂解样品液, 进行 SDS-PAGE 蛋白电泳, 表达产物电转移至硝酸纤维素膜上 , 进行 Western-blot 反应 , 通过 BandScan 5. 0软件对杂交图进行分析 ,以β-actin 做为定量 Marker ,20pmo l 为定量单位。

 

1. 7    统计学分析应用

 

t  检验进行差异分析,以 P <0. 05为差异有显著性意义。

 

2       结果

 

2. 1    PCNA shRNA 对细胞增殖的影响

2. 1. 1    细胞光镜观察见图 2 、3 。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

图 2  未转染的 Hela 细胞 24h 后细胞形态(×200)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

图 3 转染了 pGenesil-PCNA-1-4 Hela 细胞 24h 后细胞形态(×200)

 

由上图可知正常细胞呈致密的上皮 , 在转染了四种引物的真核表达载体 24h 后, 细胞都发生显著变化,周边细胞脱落死亡, 细胞形态呈梭形 ,中间细胞聚集成团 ,类似于孤岛状 。

2. 2    流式细胞仪(FCM)检测细胞周期 见图 4A 、

 

B  。