靶向 siRN A 对人子宫颈癌细胞的抑制作用

 

黄 浩^{1 , 2}   余南才²   江 俊³     刘 倩²     马 威²     郝建军²        易艳东²

 

¹华中科技大学同济医学院基础医学院病原生物学系, 武汉 430030

2 武汉市第一医院中心实验室, 武汉 430022

3 华中科技大学同济医学院保健科, 武汉 430030

 

摘要 目的 构建增殖细胞核抗原(PCN A)的小发夹结构 RN A(shRN A)的真核表达载体并在人 HeL a 细胞表达,同时观察 PCN A shRN A 对 He La 细胞体外增殖及生物学特性的影响。 方法 将 PCN A cDN A 的 shRN A 引物插入真核表达载体 pGenesil-1 , 构建真核表达质粒 pGenesil-1-PCN A(1-4), 并通过酶切和测序等方法进行鉴定, 将真核表达质粒 pGenesil-1-PCN A(1-4)转染 HeL a 细胞, 运用 We ste rn blo t 方法检测 PCN A 蛋白的表达, 流式细胞仪分析细胞周期变化。结果 PCN A shRN A 能显著抑制人 He La 细胞的生长, 阻滞细胞于 G0 /G1 期 , P CNA 的蛋白表达同时受到抑制。 结论 PCN A shRNA 能显著抑制人 He La 细胞的生长, 其抑制作用可能通过阻断 P CNA 蛋白表达实现, 实验结果为进一步研

 

究 P CNA shRN A 对子宫颈癌的基因治疗奠定了基础。

 

关键词 子宫颈癌; 增殖细胞核抗原; 小发夹结构 RN A

 

中图法分类号 R737. 33

 

Inhibitory Effect of Targeted Small Hairpin RNA on the Growth of Cervical Carcinoma Cells

 

		H uang H ao1 , 2 , Yu Nancai2 ,	Jiang Jun3  et al
1	Department of	Pathogentic Biology , S chool o f	Basic Medica l S ciences, Tong ji Medical
	College , Huaz hong University o f Science and T echnology , Wuhan 430030
2	Center o f E xperimental Medicine , Wuhan F irst Hospital , Wuhan 430022
3	Department of	Health , T ongj i Medical College , Huazhong

University o f Science and T echnology , Wuhan 430030

 

Abstract Objective T o construct eukary otic expressio n plasmid of small hairpin RN A (shRNA) targ eting PCN A , e x-pre ss plasmid in He La cells a nd investig ate the inhibitory effect of shRN A ta rge ting PCN A on proliferation and biolo gical fea-ture s o f He La cells in v itro. Methods T he cDN A shRNA prime of P CNA wa s inserted into do wnstream of the vecto r pG ene-

 

sil-1 to obtain the recombinant eukary o tic ex pression pla smid pGe nesil-1-PCN A 1-4 w hich w as identified w ith the metho ds of e n-zyme dig estion and sequence analy sis. pG ene sil-1-PCN A1-4 was tranfec ted into H eLa cells. T he ex pression o f PCN A pro tein

 

was de tected by Western blo t and the chang es o f cell cy cle by flow cy tometry. Results shRN A of PCN A co uld sig nificantly in-hibit the g ro w th of HeL a ce lls and a rrest H eLa cells in G 0 /G1 - S phase. Also the e xpressio n of P CNA pro tein w as inhibited.

 

Conclusion shRN A o f PCN A co uld sig nificantly inhibit the g ro w th o f HeL a cell lines by suppressing the ex pression of PCN A protein, which lay ed the foundation for furthe r research on ge ne therapy o f ce rvical carcinoma.

Key words    cervical carcino ma ; pro life rating cellula r nuclea r antigen ; small hairpin RN A

 

RNA 干预(RNA interference , RNAi)本质是一种双链 RN A(do uble-stranded RNA , dsRNA)分

 

子在 m RNA 水平上关闭相应序列基因的表达或使其沉默的过程, 也就是序列特异性的转录后基因沉

 

默^{[ 1]} (post-transcriptional gene silencing , PTGS)。 shRNA 是 45-50-mer 的小发夹结构 RNA (small hairpin RNA , shRNA), 通过将其转染到细胞 , shRNA 在细胞内会自动被加工成为 siRNA , 从而

 

引发基因沉默或者表达抑制^{[ 2]} 。

 

增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear anti-

 

黄 浩, 男, 1972 生, 博士研究生

 

 

gen , PCNA)是在细胞周期 S 期广泛表达的一种核蛋

 

白 ,是一种仅在增殖细胞中合成和表达的 36 kD(1 kD

 

=0. 992 1 ku)多肽^{[ 3]} 。我们根据 PCNA cDNA 的序列设计 shRNA 的引物,插入真核表达载体 pGenesil-1 ,构建正确的真核表达质粒,导入 HeLa 细胞中,并

 

研究 siRNA 对 HeLa 细胞生长的影响。为 RNAi 干

 

预技术应用于肿瘤的基因治疗提供实验依据。

 

1       材料与方法

 

1.  1  细胞培养

 

H eLa 细胞来自武汉大学生命科学院 , 培养于含 10 %小牛血清的 DMEM 培养液中, 37 ℃,5 %的

黄 浩等. 靶向 siRNA 对人子宫颈癌细胞的抑制作用	17

 

CO2 条件下培养 ,采用 0. 3 %的胰酶消化和传代 。

 

1. 2    shRNA 设计和合成

 

根据 PCNA 基因序列(NM_ 182649), shRNA 设计规则及 blast 同源搜索选取 、设计 4 对引物及 1 对对照引物 , 每 1 对引物上游含 B amH Ⅰ 切点后 GA TCC 的黏性末端, 引物下游互补端含 Hind Ⅲ切点的互补的 T TCGA 黏性末端 , 引物均由武汉市晶赛生物技术有限公司合成。

 

1. 3    PCNA shRNA 真核表达载体的构建

 

将真核表达载体 pGenesil-1(武汉市晶赛生物

 

技术有限公司)经 BamH Ⅰ 、H ind Ⅲ双酶切 ,并与纯化的 PCNA shRNA 4 对引物片段和 1 对对照引物片段进行线性连接 ,连接产物转化大肠埃希菌感受态细胞 DH 5α, 经小量提取质粒测序鉴定 。构建的表达质粒称 pGenesil-PCNA-1 、pGenesil-PCNA-2 、 pGenesil-PCNA-3 、pGene sil-PCNA-4 、pGenesil-PC-NA-H K 。

 

1.  4  阳离子聚合物介导的细胞转染

 

细胞培养至 40 %～ 60 %汇合, 配制不同浓度的pGenesil-PCNA(1-4)和 pGenesil-PCNA-H K , 分别

 

为 5. 0 、7. 5 、10. 0 、12. 5 、15. 0 μg /m l 梭华-Sofast ^TM / DNA 复合物,进行转染,具体操作步骤见试剂盒(武汉市大风生物有限公司)说明书。

 

1.  5  流式细胞仪(FCM)检测

 

收集 1. 0 ×10⁶ 细胞, 用 70 %冷乙醇固定, 加 RnaseA (终浓度 50 μg /m l), 用 37 ℃水浴 1 h , 加碘化丙啶(PI , 终浓度 20 μg /ml),避光冰浴染色 1 h 。用流式细胞仪检测细胞周期分布, 通过 M odF-itLT3. 1 软件分析结果 。

 

1. 6    Western blot 方法定量检测 PCNA 蛋白

 

将转染及未转染细胞 ,以裂解液裂解后, 收集细

 

胞 , 取 20 μl 裂解样品液 ,SDS-PAGE 蛋白电泳, 表达产物电转移至硝酸纤维素膜上 , 进行 Western blo t 反应, 通过 BandScan5. 0 软件对杂交图进行分析,以 β-actin 作为定量 Marker , 20 pmo l 为定量单位。

 

1.  7  统计学分析

 

采用 t 检验进行统计学分析 , 以 P <0. 05 为差异有显著性意义。

 

2       结果

 

2. 1    PCNA shRNA 对细胞增殖的影响

 

未转染细胞呈致密的上皮, 在转染了 4 种引物的真核表达载体 24 h 后 , 细胞都发生显著变化 , 周边细胞脱落死亡 ,细胞形态呈梭形 ,中间细胞聚集成

 

团 ,类似于孤岛状 。见图 1 。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

A  :未转染的 HeL a 细胞;B :转染了 pG enesil-PCN A(1-4)24 h 后 He La 细胞

 

图 1  H eLa 细胞形态观察(×200)

 

2.  2  流式细胞仪(FCM)检测细胞周期分布

 

通过 ModFitLT3. 1 软件分析细胞周期图, 未转

 

染 HeLa 细胞培养 24 h 后, G0 /G1 期细胞比例为

 

38. 42 %,S 期 38. 27 %,G2 /M 期 23. 31 %, 转染 12. 5 μg /ml pGenesil-PCNA-4 ,24 h 后G0 /G1 期占56. 45 %, S 期 30. 32 %,G2 /M 期 13. 32 %。

 

在 pGenesil-PCNA(1-4)转染的各组肿瘤细胞中 ,G0 /G1 期细胞数明显增多(P <0. 05),S 期细胞数明显减少(P <0. 05), 在转染 pGenesil-PCNA-4

 

时G2 期细胞数明显减少(P <0. 05)。见表 1 。提示 pGene sil-PCNA(1-4)可能延缓了肿瘤细胞由 G1 期

 

向 S 期的过渡 。

 

表 1  流式细胞术分析细胞周期(x ±s , %)

 

组别	G 0 /G 1期				S 期		G2 /M 期
未转染 H eLa 细胞	38.	42	±1. 22	38.	27	±1. 61	23.	31	±0. 85
pG enesil-PCNA-HK	36.	13	±2. 52	37.	43	±1. 71	26.	44	±2. 92
pG enesil-PCNA-1	50.	18	±7. 31 △▲ 27.		71	±6. 22 △▲	22.	11	±1.	93
pG enesil-PCNA-2	49.	15	±5. 62 △▲ 26.		66	±4. 31 △▲	24.	19	±3.	61
pG enesil-PCNA-3	52.	64	±5. 62 △▲ 28.		37	±7. 34 △▲	18.	99	±2.	81
pG enesil-PCNA-4	56.	45	±7. 32 △▲ 30.		32	±6. 41 △▲	13.	32	±2.	52	△▲
与未转染组比较 △P <0.				05 ;与转染 pG enesil-PCN A-
H K 组比较 ▲P <0. 05

18                                                华中科技大学学报(医学版)           2007 年2 月第 36 卷第 1 期