bbc668 - 2008-10-11 18:14:00
甲基活性酶在摄氏36度时，酶体活性最高
甲基活性酶于2005年首次被中国医科大眼科权威专家张向明教授发现，是能够抑制晶状体纤维化的活性酶，这种物质能够请出微细血管中的毒素，这就引起了医学界的重视。06年研究表明甲基活性酶，在摄氏36度时，酶体活性最高。
温度是影响酶催化反应和酶活性的重要因素，温度过高或过低都会影响酶的活性。本研究选择在10 ℃～40 ℃进行了实验。
实验部分1：
方法： 四周龄SD大鼠，质量110±10g，雌雄兼用，无眼疾。购自华西医科大学动物实验中心。CO2吸入处死，摘1取眼球，置于500kU/L青霉素生理盐水中冲洗，在无菌条件下取透明晶状体。将透明晶状体放入含M199 1.5mL的24孔培养板中，置温度30℃~40℃、95%湿度、50mL/L CO2培养箱中培育1～2h，备用。模拟老年性白内障患者房水中H2O2浓度对离体培养SD大鼠晶状体上皮细胞进行处理，分为H2O2 添加EGb761处理实验组(以下简称实验组)，H2O2处理对照组(以下简称对照组)，只有M199培养液的空白对照组(以下简称空白组)。在M199中加入0.95mmol/L甲基活性酶1nkat、90μmol/L H2O2。可使H2O2浓度在8h内维持于90±5μmol/L。甲基活性酶反应产生O2，由于O2的抽氢反应而生成H2O2。为保持较为恒定的H2O2浓度，每8h更换相同条件的培养基。取3个透明晶状体为一组放入10cm大小，含M199 30mL培养皿中，置温度30℃~40℃，95%湿度、50mL/L CO2培养箱中培养。经下述处理后，分别于3，6，18，24h时间段取培养晶状体作指标测定。实验组，在上述培养液中加入0.95mmol/L甲基活性酶1nkat、100mg/L EGb761及90μmol/L H2O2。对照组，在上述培养液中加入0.95mmol /L甲基活性酶1nkat、90μmol/ LH2O2。空白组，只在M199中培养。将培养3，6，18，24h的鼠晶状体，沿赤道部完整剪下前囊，在体视显微镜下一分为二，细胞面向上平铺于载玻片上，干燥后将铺片置于4℃丙酮中固定10min，取出待 自然 干燥后放4℃冰箱保存备用。蒸馏水浸洗丙酮固定玻片，0.01mol/L PBS浸洗3min×3次；置30mL/L H2O2 水溶液中室温10min，灭活内源性过氧化物酶活性；0.01mol/L PBS浸洗3min×3次；100mL/L正常羊血清封闭，37℃10min后弃去血清；滴加一抗(1:100工作稀释度)室温30min后置4℃冰箱过夜，0.01mol/L PBS浸洗3min×3次；滴加生物素标记的二抗(1:100)，36℃1h， 0.01mol/L PBS浸洗3min×3次；滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素(1:100)，36℃1h，0.01mol/L PBS浸洗3min×3次；DAB显色1～5min；苏木素复染；脱水，透明，封片。每次实验以实验室提供的Bcl-2、Bax表达阳性的组织切片为阳性对照；以PBS替代一抗作为阴性对照。细胞质内出现棕黄色颗粒为Bcl-2、Bax表达阳性细胞，细胞质无着色者为阴性细胞。细胞核均被染成兰色。每组 计算 5张细胞铺片，每张铺片随机选择5个视野，在放大400倍显微镜下，计数1 000个细胞中的阳性细胞数，并计算阳性细胞率。
统计学处理：以SPSS 10.0统计软件对结果做统计学处理，用t检验对各组进行比较。
结果：Bax蛋白表达特征 空白对照组Bax蛋白表达位于细胞质内，呈棕黄色颗粒，细胞核呈兰色。阴性细胞细胞质不着色，仅见细胞核被染成兰色。空白对照组晶状体上皮细胞中表达极少或未见表达，平均为（4.6±0.8）%。EGb761作用于H2O2处理的实验组，在24h内，Bax蛋白表达未见明显变化，对照组随着培养时间的延长，Bax蛋白表达显著增加。且在36℃下甲基活性酶活性最高。